紫花三叉小白芨组培快繁技术研究 [复制链接]

　　白芨[Bletillastriata（Thunh.）Reichb.f.]是兰科白芨属多年生草本块茎植物，别名紫兰根，李时珍释其名：其根白色，連及而生，故曰白芨[1]；白芨花色有紫花、白花、黄花，花色艳丽，是一种观赏价值极高植物[2]，具有收敛止血、消肿生肌等功效[3-4]。近年来，白芨不仅作为传统中草药，由于其中含较高的白芨胶可替代阿拉伯胶等胶剂作为混悬剂及乳化剂，广泛用于食品及化工领域[5]，还因其观赏价值极高被大家喜爱。因此，白芨的需求量急剧增加，价格逐渐递增，年突破元/kg。野生资源遭到过度采挖，资源急剧减少，濒临灭绝，现已被国家列为重点保护的野生药用植物之一。由于白芨种子非常细小且又无胚乳，在自然条件下很难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，传统栽培主要靠分株繁殖[6-7]，但分株繁殖周期长，效率低，耗种量大，难满足市场需求。为了保护白芨野生资源，保护生物多样性，人工培育和栽培白芨迫在眉睫。白芨蒴果无菌播种技术已基本成熟[8-9]，但驯化栽培成活率较低瓶颈难以突破。为了探索白芨组培苗驯化栽培最佳途径，笔者于—年，采用从红河冷泉引进的紫花三叉小白芨移栽后，开展人工授粉、无菌播种、自然光下增殖和生根培育、移栽等关键技术的试验研究，为白芨产业化发展提供技术支持。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　紫花三叉小白芨种源是从红河冷泉引进栽培于云南省德宏热带农业科学研究所引种圃，4—5月开花盛期选取健壮的母株进行人工授粉，授粉后套袋，7～10d花调谢，8—9月为蒴果成熟期。测定果重0.55～1.01g，果长～32.66mm，果直径7.87～10.90mm，种胚长0.mm，宽0.mm（图1～2）。

　　1.2试验方法

　　1.2.1无菌播种。

　　选发育正常饱满成熟未开裂的蒴果，用0.1%洗洁精洗净，置于超净工作台上，用75%酒精消毒60s，再用0.1%HgCl2灭菌15min，然后用无菌水冲洗5～6次，过滤纸吸干水分，酒精灯烘烤蒴果表皮，切开蒴果，将种子播种于不同基本母液及不同添加物培养基上，采用基本母液MS改良为MB（无水氯化钙和硝酸钾减半、肌醇不用），每种培养基均匀播种5瓶，pH为5.8～6.0，培养温度（25±2）℃，光照强度1～lx，光照时间8～10h/d，培养50d后统计萌发率。

　　1.2.2继代增殖分化培养。

　　将种子萌发形成的原球茎接种于继代增殖培养基上培养，以1/2MB为基本培养基，添加马铃薯泥50g/L和香蕉泥20g/L及不同浓度的6-BA和NAA，共9种，每种培养基接种5瓶，用封口膜封2.0～2.5圈。将继代增殖分化培养瓶苗置于搭建好的塑料大棚内梯形多层培养架上进行自然光培养，用白色塑料薄膜遮盖培养瓶，荫蔽度为70%～80%，培养温度22～30℃，培养60d后，统计增殖倍数。

　　1.2.3壮苗生根培养。

　　将丛生芽分切割单芽，株高达到3cm以上接种到不同有机物组合及NAA0.5mg/L的培养基中进行生根培养，共4种，每种壮苗生根培养基接种5瓶，将瓶苗置于自然光下搭建好塑料大棚苗床上培养，荫蔽度为60%～70%，温度控制在30℃以下，炼苗培养60d后，统计株高、生根数量、生根长度。

　　1.2.4移栽。

　　将株高5～7cm生根苗取出，用清水洗干净根部的培养基，置于0.1%高锰酸钾或倍多菌灵溶液中浸泡5～10min，捞出晾干至根发白，移栽于5种不同基质中（腐熟艾蒿、腐熟锯木渣、腐质土、火烧土不同体积比），株行距5cm×5cm，荫蔽度70%～80%，湿度60%～70%，温度控制在30℃以下。移栽后10～15d结合浇水施沼液肥。

　　2结果与分析

　　2.1不同基本母液对白芨种胚萌发率的影响

　　采用白芨4～5个月基本成熟的种胚，以不同基本培养基（1/2MS、MS、1/2MB、MB、N6、B5、花寶1号）上萌发培养，白芨种子无菌播种10～15d后，种子慢慢吸水膨大，由黄褐色变成绿色，30d后诱导大量原球茎，50d后原球茎发出绿色芽尖。由表1可知，白芨种胚在基本培养基中，1/2MB种胚萌发率最高为90%，生长快，原球茎粗壮；1/2MS种胚萌发率较高，为88%；MS和MB种胚萌发率最低，原球茎分化少；N6、B5、花宝1号种胚萌发率略低，但原球茎长得较粗壮。

　　2.2不同添加物对白芨种胚萌发的影响

　　由表2可知，在1/2MB培养基中添加马铃薯泥20g/L、香蕉泥20g/L、艾蒿叶2g/L的不同添加物对种胚均有较高萌发率，分别为95%、92%、93%，高于对照（CK）90%；但在培养基中添加西瓜汁20g/L、番茄汁20g/L、活性炭2g/L对种胚萌发率较低，分别为86%、88%、89%，由于艾蒿叶成本低，对种胚萌发快，苗粗壮，有利于白芨规模化生产时降低成本。可见，在原球茎增殖分化培养基中添加适量浓度的有机添加物（马铃薯泥、香蕉泥、艾蒿叶）对种胚的萌发有促进作用。

　　2.3不同植物激素组合对白芨增殖分化的影响

　　将种子萌发的分化幼苗接种于添加不同植物激素配比的培养基中，12d后从幼苗假鳞茎基部长出小芽，小芽不断分蘖长出丛生芽。由表3可知，9种增殖分化培养基中，以A5处理（1/2MB+马铃薯泥50g/L+香蕉泥20g/L+6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+艾蒿叶干粉2g/L培养基）诱导效果最好，增殖倍数最高，为14.2倍，分化的小苗整齐均匀，叶片厚、深绿色，生长快而粗壮。当6-BA浓度为0.6mg/L时，分化的小苗假磷茎较多，分化的小苗叶片细长，再分化能力变弱。

　　2.4艾蒿、活性炭和香蕉泥对白芨生根苗的影响

　　将长至高3cm以上的幼苗接种到不同有机物组合培养基中进行生根培养，从表4可知，4种生根培养基中，以B1处理（1/2MB+NAA0.5mg/L+艾蒿叶干粉4g/L+香蕉泥80g/L培养基）诱导生根效果最好，平均株高8.6cm，平均茎粗0.28cm，平均生根数4.2条，平均根长3.5cm，生根苗粗壮，叶片舒展，根系多而粗壮；其次，以B3添加活性炭培养基诱导生根效果较好，平均株高7.2cm，平均茎粗0.26cm，平均生根数3.9条，平均根长3.3cm；当香蕉泥浓度为40g/L时，生根苗明显变细弱，说明艾蒿和香蕉泥对白芨生根均有显著促进作用，且对幼苗的生长也有一定的促进作用。添加活性炭的培养基上幼苗较高，根系较长，活性炭会吸附培养基中由白芨生长代谢产物的有毒物质，也会吸附部分营养物质，可见活性炭对生根有抑制作用；而添加香蕉泥培养基上幼苗和根系明显粗壮。可见，艾蒿有利于根茎伸长生长，香蕉泥更有利于根茎横向生长，两者的合理组配是培养白芨生根苗的关键。

　　2.5不同基质比体积对移栽成活率的影响

　　白芨生根苗在自然光下培养70d，叶片厚大、舒展，叶色转深绿色，基部产生小球茎、粗壮，白色根增多、粗壮。由表5可知，以处理C5腐熟艾蒿∶腐熟锯木渣∶腐质土∶火烧土（1∶2∶4∶3）比体积的复合基质最好，移栽成活率达94.7%，生长抽芽快。
　　3讨论与小结

　　在白芨组织培养快繁过程中，种子萌发时，原球茎在MS培养基中生长缓慢，在改良的1/2MB培养基中生长良好，说明高浓度的无机盐对原球茎的增殖分化有抑制作用，该试验结果与袁宁等[10]的研究结果相符合。无菌播种获得原球茎如不及时转接到增殖分化培养基中，原球茎很快分化呈小苗，影响分化率；在种子萌发时，添加不同的有机物，白芨种子萌发、出苗情况也不同，其中以马铃薯效果最佳，艾蒿叶次之，西瓜汁最差，这与张燕等[11-12]报道的相同。在显微镜下观察，白芨种子的种胚比石斛兰种子的种胚要大且饱满，积累的营养成分更多，白芨的胚萌发直接分化长成小苗，这与张建霞等[13]报道的相同。

　　在原球莖增殖分化培养基中添加适量浓度马铃薯泥、艾蒿叶和香蕉泥不同组合对种胚的萌发有促进作用，采用6-BA和NAA不同浓度的组合对丛生芽进行增殖培养，以6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L组合增殖诱导效果最好，增殖系数为14.2倍，增殖分化苗在自然光下培养60d，叶片深绿色，假鳞茎上分化的幼苗明显增多；NAA是影响白芨生根的主要原因，NAA浓度过高，生根苗易黄化，褐化严重，易出现畸形苗，NAA浓度过低，对白芨组培苗的生根率、生根数、根的粗细有直接影响，在培养基中添加NAA0.5mg/L生根诱导效果较好。艾蒿具有抗菌和抗病毒作用，在培养基中添加艾蒿叶对白芨种子的萌发、增殖分化、生根有一定促进作用，艾蒿在培养的过程中是否对污染率也有所降低还有待进一步研究。

　　白芨生根苗的质量是影响移栽成活率的重要因素，选择健壮的生根苗，能提高移栽成活率，达到预期的效果。在该研究中，通过对不同生根瓶苗在不同的环境条件下培养及移栽于不同基质比体积中进行系统比较，结果表明，生根瓶苗在自然环境条件下培养60d，随着光照时间的延长，白芨幼苗假鳞茎随着增大，移栽成活率最高，主要是因为白芨生根瓶苗在自然光充足的环境下培养，温湿度是影响白芨生长的关键因素，温湿度过大幼苗易黄化，甚至腐烂，温度超过30℃，需要加盖遮阳网，大棚注意通风及喷水降温，雨季要搭建拱棚防雨，减少污染。

　　由于光照充足，幼苗基部易形成假鳞茎多而大，叶片变宽大而厚，植株粗壮，脱瓶清洗时，幼苗假鳞茎呈丛生状态，根系粗壮，移栽成活率较高。采用腐熟艾蒿∶腐熟锯木渣∶腐质土∶火烧土（1∶2∶4∶3）比体积的复合基质移栽，保肥、保水性好，移栽成活率达94.7%。